PuSH - Publication Server of Helmholtz Zentrum München

Miller, M. ; Zorn, D.J.* ; Brielmeier, M.

Hochauflösende Schmelzkurvenanalyse zur Speziesidentifizierung bei Pasteurellaceae.

Vortrag: 52. Wissenschaftliche Tagung der Gesallschaft für Versuchstierkunde GV-SOLAS, 10-12 September 2014, Frankfurt am Main. (2014)
EINFÜHRUNG: Pasteurella pneumotropica gehört mit einer Prävalenz von 12,9% zu den häufigsten bakteriellen Pathogenen in europäischen und nordamerikanischen Labortierhaltungen1. Gemäß der neuesten FELASA Empfehlungen zum Hygienemonitoring muss aus der Familie der Pasteurellaceae  die Spezies Pasteurella pneumotropica identifiziert werden2. Gängige Nachweismethoden dafür führen allerdings häufig nicht zu zufriedenstellenden  und zuverlässigen Ergebnissen, weshalb eine sichere Nachweismethode gefunden werden sollte. Dazu wurde eine Real-Time PCR in Verbindung mit einer hochauflösenden Schmelzkurvenanalyse (HRMA) etabliert und anhand aus verschiedenen Versuchstierhaltungen isolierter Bakterienkulturen getestet. METHODEN: Verschiedene Referenzspezies (u.a. Pasteurella pneumotropica Biotyp „Jawetz“ und „Heyl“, Actinobacillus muris) sowie 25 lediglich biochemisch charakterisierte Isolate eines externen Diagnostiklabors wurden kultiviert und deren DNA isoliert. Die auf Basis des 16s rRNA Gens konstruierte Real-Time PCR3 mit nachfolgender HRMA wurde am Rotor-Gene Q (Qiagen) durchgeführt. Während der HRMA wird das bei der PCR entstandene Amplikon durch einen kontrollierten Temperaturanstieg denaturiert und mittels interkalierendem Farbstoff ein exakter Schmelzpunkt mit charakteristischem Schmelzprofil ermittelt. RESULTATE: Die verschiedenen Referenzspezies sind anhand ihrer Schmelzpunkte und Schmelzprofile eindeutig voneinander unterscheidbar. Der Großteil der 25 biochemisch charakterisierten Pasteurellaceae-Kulturen konnte den Referenzspezies eindeutig zugeordnet werden. Bei vereinzelten Isolaten, deren Amplikonsequenz durch Punktmutationen nicht exakt dem Referenzstamm entspricht, liefert die Lage des Schmelzpunktes einen deutlichen Hinweis, welcher Spezies diese Kultur zugeordnet werden könnte. Zur Bestätigung der HRMA-Ergebnisse wurde das Amplikon sämtlicher verwendeter Proben sequenziert. SCHLUSSFOLGERUNGEN: Die hochauflösende Schmelzkurvenanalyse ermöglicht eine rasche, kostengünstige und zuverlässige Differenzierung verschiedener Pasteurellaceae-Spezies anhand einer beliebig erweiterbaren Sammlung von Referenzen. Neue, noch nicht in der Sammlung enthaltene Stämme müssen dafür zunächst mittels Sequenzierung identifiziert werden. Zusätzlich bietet die Kombination von HRMA und Real-Time PCR die Möglichkeit neben der Identifizierung auch eine Quantifizierung durchführen zu können.
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Publication type Other: Lecture
Conference Title 52. Wissenschaftliche Tagung der Gesallschaft für Versuchstierkunde GV-SOLAS
Conference Date 10-12 September 2014
Conference Location Frankfurt am Main
Institute(s) CF Comparative Medicine (AVM)